药学专业毕业论文开题报告 doc

一 课题研究的目的与意义、国内外研究的发展概况和趋势

1 课题研究的目的与意义

连花解毒颗粒由金银花、牛蒡子、芦根等多味中药提取制成，该处方是我院中医科专家长期在临床使用的验方，具有清热解毒，凉血利咽，宣肺化痰，止咳平喘的功效。临床适用于风热感冒，温病初起，流感、上呼吸道感染、咽炎、支气管炎、腮腺炎、斑疹等病症治疗[1－5]。

中医理论认为：由于风热之邪犯表，则热郁肌肤腠理，卫表失和，故见身热较著，微恶风，汗泄不畅等症；风热上扰则头胀痛；风热之邪上犯则咽燥或咽喉红肿疼痛，口渴欲饮、鼻塞、流黄浊涕。中医的“毒”含义甚广，清热解毒中药所解之的“毒”为火热壅盛所致的“热毒”及“火毒”，主要用于温热病及热毒炽盛症。随着现代医学的不断发展，清热解毒中药所解之“毒”不仅包括“外源性之毒”(细菌、病毒、内毒素)，还包括氧自由基和细胞因子过度释放等“内源性之毒” [6]。

连花解毒颗粒所含主药均为清热解毒中药的典型代表，利用动物发热模型对发热过程进行模拟，从而对解热作用进行进一步研究。本课题还对药物的急性毒性进行了考察，为临床安全用药提供了实验数据和理论基础。

2 国内外研究的发展概况和趋势

目前，国内外研究药物急性毒性的方法有很多，经典的有半数致死量试验（50% lethal dose，LD50）、最大给药量试验等，除此之外，还有限量试验、近似致死剂量实验、扩展试验、固定计量法、剂量累积试验等。中药新药中应用最多的是半数致死量和最大给药量试验。

《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》规定未在国内上市的由中药、天然药物组成的非注射给药的复方制剂，如该复方制剂处方组成符合中医药理论，有一定的临床应用经验，一般情况下，可采用一种动物，按临床给药途径进行急性毒性反应的观察。本课题选用啮齿类动物小鼠为实验动物，采用口服给药方式，对连花解毒颗粒进行急性毒性反应的研究。

发热是清热药最主要的适应症之一，解热作用是清热药的一个重要共性。在实验中可以采用多种方法来引起实验动物发热，如细菌或细菌产物、造成无菌炎症、化学药物、刺激丘脑体温调节中枢及暴露于高热坏境等，这些发热模型均可用于解热实验研究，如目前国内外常用的有注射腐败枯草浸液、角叉菜胶、牛乳或蛋白胨、加热杀死的革兰阴性菌（大肠杆菌、伤寒或副伤寒杆菌、痢疾杆菌）菌液、伤寒副伤寒菌苗、啤酒酵母、2,4—二硝基苯酚等发热方法研究中药的解热作用。为了进行机制分析或特殊研究目的，还可选用内生致热原生成及发热试验、微量PGE脑室内或下丘脑注射致热试验、Lipid A、IL-1、干扰素及TNF性发热试验等 [7]。

本课题选用啮齿类动物大鼠为实验动物，拟采用角叉菜胶为发热模型致热源，皮下注射可于局部产生强烈的炎症反应，此炎症的形成主要与其诱导前列腺素生物合成及释放有关，可引起一个持续炎症反应，并激活巨噬细胞引发发热。因其来源不同，其致热作用有些差异，故于正式实验前宜先做预试验，以选择适宜的种类、浓度与剂量，此外在预实验阶段观察大鼠体温变化全过程。

二 主要研究内容

本课题采用啮齿类动物大鼠和小鼠以口服给药方式，对连花解毒颗粒进行以下两个方面进行研究：

（一）连花解毒颗粒急性毒性反应的研究

（二）连花解毒颗解热药效学的研究

三 主要研究方案

1 连花解毒颗粒的急性毒性实验

中药新药审评的技术要求规定，当受试药物的毒性很低，或者因浓度或体积的限制，无法测出LD50时，可仅提供最大给药量试验的结果,测定其能达到人用量的多少倍，对药物安全性进行评估，以耐受人用量口服100倍以上为安全 [8]。

1.1 溶液的配制与预实验

1.1.1 溶液的配制

连花解毒颗粒供试品1的制备：取连花解毒颗粒125.0g溶于100mL水中，搅拌均匀即得混悬药液，此作为连花解毒颗粒供试品1溶液（相当于人临床用量100倍）。

连花解毒颗粒供试品2的制备：取连花解毒颗粒188.0g溶于100mL水中，搅拌均匀即得混悬药液，此作为连花解毒颗粒供试品2溶液。

1.1.2 预实验方法：

1.1.2.1 选择体重约20g的健康小鼠10只，雌雄各半，实验前禁食不禁水12h。每只小鼠按100g/kg/d量于12h内给予灌胃供试品1溶液2次，灌胃体积为0.4mL/ 10g，给药后连续观察7天。如果小鼠全部存活，则采用最大给药量法进行实验，如果小鼠部分或全部死亡则采用LD50的测定。

1.1.2.2 选择体重约20g的健康小鼠10只，雌雄各半，实验前禁食不禁水12h。每只小鼠按150g/kg/d量于12h内给予灌胃供试品2溶液2次，灌胃体积为0.4mL/ 10g，给药后连续观察7天。

1.2 最大给药量法进行实验

选择体重约20g的健康小鼠48只，雌雄各半，分成两组，每组24只，实验前禁食不禁水12h。实验组每只小鼠按150g/kg/d量于12h内给予灌胃连花解毒颗粒供试品2溶液2次，灌胃体积为0.4mL/ 10g。对照组每只小鼠给以生理盐水，一天两次，灌胃体积为0.4mL/ 10g。两组小鼠给药后连续观察14天。期间若有死亡小鼠即刻尸解，肉眼观察小鼠主要脏器(心、肝、脾、肺、肾等)的变化，若肉眼可见异常则进行病理检查。若无14天后处死全部存活小鼠，解剖和尸检内脏器官有无异常。并记录14天内雌雄小鼠的行为活动、被毛、皮肤、呼吸、大小便、食欲，鼻、眼、口腔有无异常分泌物等情况（见附录Ⅰ）。根据公式计算出其能达到人用量的多少倍[9~11]，计算公式如下：

2 连花解毒颗粒对角叉菜胶所致大鼠发热的解热作用[13－15]

2.1 人与大鼠之间给药量的换算

表2-1不同实验动物与人的等效剂量比值（注：剂量按mg/kg算，人按照 60kg算）[12]

通过查表可知大鼠与人的等效剂量比约为6倍

实验动物用剂量＝（动物体重／人的体重）×人的剂量×6

=(0.2kg/60kg) ×60g×6=1.2g

2.2 致热因子溶液的配制与发热模型的建立

2.2.1致热因子的制备：精密称取角叉菜胶（卡拉胶）100mg置于试管中，加入灭菌生理盐水（或蒸馏水）10mL，轻轻搅拌或摇匀，放置于4℃冰箱中过夜，次日晨取出，轻轻倒置数次直至混悬液均匀。

2.2.2 发热模型的建立：取12只健康大鼠，雌雄各半，于实验前8～10 h禁食，但不禁水。实验前三天，每日测大鼠肛温2次，实验当日每小时测肛温1次，连续3次，选取体温变化不高于0.3℃的大鼠进行实验，取被选中的大鼠肛温平均值为基础体温。于大鼠两爪脚跖皮下各注射1%角叉菜胶悬液0.1mL/爪，分别于1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h测大鼠肛温，观察大鼠建模情况，如注射致热因子4小时后，大鼠体温开始升高，至6~7小时达高峰，并持续时间长于10小时，则可判断为建模成功，视情况调整致热因子的种类和剂量。

2.3 预实验观察：选取20只健康大鼠，雌雄各半，于实验前8～10 h禁食，但不禁水。实验前三天，每日用体温计测大鼠肛温2次，实验当日每小时测肛温1次，连续3次，选取肛温变化不高于0.3℃的大鼠进行实验，取被选中大鼠肛温的平均值为基础体温。以角叉菜胶作为致热因子，参考相关文献，在预实验中设置两种实验方法：

①大鼠每天给浓度为0.4g/mL连花解度颗粒3mL一次，连续3d。末次给药后，用体温计测量致热前肛温，然后于大鼠两爪脚跖皮下各注射1%角叉菜胶悬液0.1mL/爪，此后分别于1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h测大鼠肛温。

②于大鼠两爪脚跖皮下各注射1%角叉菜胶悬液0.1mL/爪，此后立即给予每只大鼠浓度为0.4g/mL连花解度颗粒3mL，分别于1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h测大鼠肛温。观察动物反应情况和体温变化，选择最佳的实验方法（给药量计算：连花解毒颗粒60kg人每天用量为60g，按体表面积折算0.2kg大鼠正常用量为1.2g，0.2kg大鼠每次灌胃3mL，即连花解毒颗粒配制的浓度为1.2g/3mL=0.4g/mL）。

2.4 连花解度颗粒解热效果正式实验：根据预实验结果，选取实验方案。大鼠于实验前8～10 h禁食，但不禁水。每日用体温计测大鼠肛温2次，连续3日，实验当日每小时测体温1次，连续3次，选取体温变化不高于0.3℃的健康大鼠，取被选中大鼠体温的平均值为基础体温。将大鼠随机分成七组，灌服以下七种药物：

①连花解毒颗粒低剂量组：0.2g/mL连花解度颗粒3mL

②连花解毒颗粒中剂量组：0.4g/mL连花解度颗粒3mL

③连花解毒颗粒高剂量组：0.8g/mL连花解度颗粒3mL

④双黄连颗粒阳性对照品组：0.2g/mL柴黄颗粒3mL

⑤阿司匹林阳性对照品组：6.7mg/mL阿司匹林3mL

⑥空白辅料对照组： 266.7mg/mL空白辅料 3mL

⑦模型组：不给药

根据预实验确定的试验方法建模，于1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h测大鼠肛温。记录每只大鼠的体温变化并绘制曲线图，利用SPSS软件分析计算，判断连花解毒颗粒组与模型组体温差别是否有统计学意义(P<0．05)，即连花解毒颗粒的解热效果（给药量计算：①连花解毒颗粒60kg人每天用量为60g，按体表面积折算0.2kg大鼠正常用量为1.2g，0.2kg大鼠每次灌胃3mL，因此配制的连花解毒颗粒中剂量组浓度为1.2g/3mL=0.4g/mL；②双黄连颗粒60kg人每天用量为30g，则大鼠正常用量为0.6g，因此配制的双黄连颗粒的浓度为0.6g/3mL=0.2g/mL；③通过查阅文献，解热实验大鼠阿司匹林对照组用量为20mg/d，因此配制阿司匹林浓度为20mg/3mL=6.7mg/mL；④连花解毒颗粒人每天用量为40g，0.2kg大鼠正常用量为0.8g，0.2kg大鼠每次可灌胃3mL，0.8g/3mL=266.7mg/mL）。

附录Ⅰ急性毒性试验的一般观察结果与可能设计的组织、器官、系统

参考文献：

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四 研究进展及具体安排

（1）2010.12.27—2011.01.23 查阅相关文献，设计实验方案，并完成开题报告

（2）2011.01.28—2011.02.15 撰写综述

（3）2011.02.24—2011.04.25 完成相关试验和结果分析

（4）2011.04.27—2011.05.07 撰写毕业论文

（5）2011.05.10—2011.05.11 论文答辩

五 预期结果

1、通过连花解毒颗粒急性毒性研究，测得小鼠的最大耐受倍数

2、通过连花解毒颗粒解热药效学研究，确定连花解毒颗粒的解热效果

3、完成毕业论文

导师审查意见

导师签名 年 月 日

实习单位意见

单位公章 年 月 日

系（院）批准意见

系（院）盖章 年 月 日

备注

第一次检查及变动记录

导师签名 年 月 日

第二次检查及变动记录

导师签名 年 月 日

课题完成日期 年 月 日

备 注