实验一_鸡新城疫血凝(HA)和血凝抑制(HI)抗体水平测定法
发布时间:2020-10-17 来源:文档文库
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鸡新城疫血凝(HA)和血凝抑制(HI)抗体水平测定法
1.本次实验的目的和要求
掌握鸡新城疫血凝(HA)和血凝抑制(HI)抗体水平测定法,以便检查疫苗使用效果和制定合理免疫程序。 2.实验内容或原理
某些病毒(如新城疫病毒,禽流感病毒等能够与动物的红细胞发生凝集,此即为红细胞凝集现象(HA。这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异免疫血清所抑制,即为红细胞凝集抑制试验(HI。 3.需用的仪器或试剂等
动物 健康成鸡2-5只,被检鸡15-25只。
器材 高压灭菌器、滤纸、试管、试管架、离心机、离心管、三棱针、内径2mm聚乙烯塑料管100cm、酒精灯、石蜡、96孔V型微量凝集试验板、0.025mm微量吸液器、微型振荡器、微量移液器、脱脂棉等。
药剂(1)浓缩抗原;(2)生理盐水或磷酸缓冲盐水(PBS);(3)Alsever细胞保存液;(4)红细胞悬液;(5)待检血清 4.实验步骤
(1发现与鉴定病毒:鸡新城疫和禽流感病毒分离后,这些病毒能凝集鸡的红细胞,又能被特异性的已知免疫血清抑制其凝集反应,即可鉴定此病毒。
(2诊断病毒性疾病:如取同一发病的动物早期和恢复期血清进行红细胞凝集抑制实验,如抗体效价有4倍以上升高,即有诊断意义。 (3)免疫机体抗体效价的测定: 3.鸡新城疫(ND)的HA和HI (1)试验准备
① 抗原:一般以鸡新城疫Ⅱ系或LaUra系冻干苗作为已知抗原,进行试验。
② 0.7%细胞悬浮液:由鸡翅静脉或心脏采血,放入含有抗凝剂的灭菌试管(按每毫升血加入3.8%灭菌柠檬酸钠0.2毫升做抗凝剂内,迅速混匀。如当时不用,可直接采血放入红细胞保存液内(保存液2份,血液1份于4℃冰箱内可保存两周。
红细胞悬液的配制:将血液注入离心管中,经3000转/分钟,离心5-10分钟,用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜,将沉淀的红细胞加稀释液(生理盐水洗涤。再用离心机3000转/分钟离心5-10分钟,弃上清,再加稀释液洗涤,如此反复洗涤三次,将最后一次离心后的红细胞泥,按0.7%的稀释度加入稀释液(0.7毫升红细胞泥加99.3毫升稀释液。 ③ 被检血清:将被检鸡群编号登记,用消毒过的干燥注射器采血,注入洁净干燥试管内(微量法可用孔径2-3毫米塑料管由翅静脉采血,在室温中静置或离心,待血清析出后使用。
每只鸡应更换一个注射器,严禁交叉使用。 ④ 稀释液:为灭菌的生理盐水。
⑤ 红细胞保存液的配制方法:葡萄糖2.05克,柠檬酸钠(SHOO0.80克,柠檬酸(2H200.055克,氯化钠0.42克,蒸馏水加至100毫升。过滤分装,高压灭菌10分钟,放4℃冰箱保存。 (2红细胞凝集试验(HA 主要是测定病毒的红细胞凝集价,以确定红细胞凝集抑制试验所用病毒稀释倍数(抗原单位。
鸡新城疫病毒的HA试验与HI试验现采用微量法,以u或v形微孔塑料板代替试管。 ① 首先用移液器向每个孔加入稀释液一滴(0.05毫升。
② 用微量移液器取病毒抗原0.05毫升,加入第一孔,反复抽动6次后,吸出0.05毫升加入第二孔,在第二孔反复抽动6次后,吸出0.05毫升加入第三孔,如此连续稀释至第十一孔后吸出0.05毫升弃去。第12孔不加病毒液为红细胞空白对照。
判断:沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀,表明红细胞未被或不完全被病毒凝集;如果孔底的红细胞铺平孔底,凝成均匀薄层,倾斜后红细胞不流动,说明红细胞被病毒所凝集。
如上例:病毒液的HA效价以出现完全凝集的抗原最大稀释度为准。HI试验时,病毒抗原液为0.05毫升内须含4个凝集单位,则应将原病毒液作成64/4=16倍的稀释液。
孔号: 1