细胞免疫荧光步骤[1](干货分享)
发布时间：2023-03-06 23:32:16 来源：文档文库
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细胞免疫荧光步骤
方法一:
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首先需要把细胞养在玻璃片上(悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片
然后在4％PＦA里面室温下固定30分钟，ＰBＳ洗两次，0.1％ TX—100室温下作用1－2分钟使细胞膜通透。
接下来进行荧光标记,需要在一个大的容器（面积大,扁平状的，比如大的培养皿）里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。 剪一片合适大小的pａrａfilm,在上面滴上稀释在1％ＢSＡ/TＢＳ中的一抗（稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片３0ul足够,把玻璃片盖在上面（细胞面朝下）,室温下孵育３0分钟，然后在PBＳ里洗三次。
接下来二抗孵育步骤同上。
最后，在载玻片加上ｍounting medium(大约每个玻璃片加10uｌ，把玻璃片放上去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。
抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WＢ检测一下你的抗体,看看有没有杂带。
双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。
方法二：
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选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rａbｂiｔ和rａt的抗体,二抗则是不同荧光信号标记 的，我用的是ｄonｋｅy ａｎtｉ—rabbiｔ－FITC（绿）和doｎkey anti-ｒat-Ｔｅx－Red（红）。
我的做法是两种一抗同时孵育,然后两种二抗同时孵育.抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过 夜比较好，背景比较清晰。
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我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG,荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
封闭血清与二抗来源动物一致,我用的是1０％的正常donｋey血清.
其余步骤同一般免疫荧光单标操作.
方法三：
1. 片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片,还有直接在2４welｌ/12well/９6wｅll中直接染色
2. 细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片
3. 细胞甩片:需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。 4. 其实小的weｌl的话,可以直接拿来染色，没问题的。
5. 固定:用PBS洗去培养液,用固定液(如甲醇和丙酮；４％多聚甲醛;酒精.。。固定细胞。
6. 内源性过氧化物酶处理，3%过氧化氢处理细胞(选作，二抗连HRP得必做,其他的如做免疫荧光染色不用做. 7. 通透（胞浆蛋白和细胞核蛋白需要做;细胞膜蛋白不需要做，一般选用Tｒiton—Ｘ10０来做细胞通透，浓度和时间需要摸索，一般是0。1—5%,处理时间为1-30分钟，级个别需要到1－2小时。
8. 封闭:洗去通透液，用二抗同源的血清约1０％的浓度in PBＳ中封闭半小时，也可以选用5
