细胞免疫荧光实验步骤

细胞爬片免疫荧光实验步骤



第一天：



1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；



2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min；



3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；



4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；



5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；



第二天：



6. 加荧光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。



7. 复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。

细胞免疫荧光步骤 

1.在24孔板里加500微升培养基，放爬片，接种细胞（做实验以30-50%汇合度较好。10000-30000左右 2.给药处理24h。 3.PBS洗三遍。 

4. 4％冷的多聚甲醛固定15分钟，PBS洗三遍，每次5min，摇床。（避光） 5.0.5％Triton X－100（PBS配）破膜15min，PBS洗三遍，每次5min，摇床。 6.5%BSA（牛血清白蛋白，PBS配）封闭60分钟,不用洗。 7.加一抗孵育（5%BSA配），4℃摇床过夜。 

8. 收集一抗，PBS洗三遍，每次5min，摇床。孵育二抗Alexa Fluor 488（1:1000 ）,室温60min（避光） 

9. 回收二抗，PBS洗三遍，摇床，每次5min。 

10. 0.5ug/mLDAPI（5%BSA配，2滴/ml）染核15min。（避光） 

11. PBS洗三遍，每次5min，摇床。 

12.取载玻片，滴加10uL抗荧光衰减封片剂，将爬片有细胞面盖在封片剂上，指甲油封片子的对角线。 

All steps for IF

1)    Remove culture medium and fix cells (a common fixative is 4% 

formaldehyde in PBS, for 15 minutes) 

2)    Wash well in PBS (3 x 5 minutes is typical) 

3)    Permeabilize the cells (a common permeabilization reagent is 0.2% Triton X-100 in PBS for 30 minutes) 

4)    Wash well in PBS 

5)    (optional:  Block for non-specific dye binding using the Image-iT FX Image Enhancer Solution, I36933) 

6)    Block for non-specific antibody binding 30-60 minutes (a common blocking solution would be 3-6% bovine serum albumin / 5% normal goat serum / PBS, or commercial blocking reagents like our BlockAid, product B10710) 

7)    Incubate in primary antibody for 30-60 minutes, in blocking solution or overnight at 4 degrees (antibody concentrations vary, but usually between 0.5-10ug/mL) 

8)    Wash well in PBS 

9)    Incubate in secondary antibody for 30-60 minutes, in 3-6% bovine serum albumin / PBS  (a good starting antibody concentration is 5 ug/mL) 10) Wash well in PBS 

11) Counterstain as needed (such as with DAPI, D1306) 

12) Mount in appropriate mounting medium (for fluorescent secondaries, a good antifade solution is best, such as ProLong Gold, P36934, or SlowFade Gold, S36937) 

本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/6c8c10b59fc3d5bbfd0a79563c1ec5da50e2d6ac.html