对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱测定
一、实验目的
⒈学习高效液相色谱用保留值定性和用归一化法定量的技术。
⒉熟悉高效液相色谱分析操作。
3.掌握用高效液相色谱法测定食品中防腐剂的含量。
二、实验原理
高效液相色谱仪是一种色谱分析仪器，主要用于有机化合物的分析，可以对已知80%左右的有机化合物进行分离和分析。特别适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物以及生物活性物质的分离和分析。液相色谱仪在医药、食品、农业、生命科学、化工和环保等领域都有广泛的应用。
液相色谱分析方法实质上是一种物理化学分析方法，又称色层法或层析法。它是利用不同物质在两相（固定相和流动相）中具有不同的分配系数和吸附能力及其他亲和作用性能的差异为分离依据，当混合物中各组分随流动相移动时，在两相中反复进行多次分配，从而使各组分得到分离。
流动相为液体的色谱分析叫做液相色谱分析。根据分离原理的差异，液相色谱通常分为以下几种类型：液固吸附色谱、液液分配色谱、离子交换色谱和离子对色谱、凝胶色谱。
在对羟基苯甲酸酯类混合物中含有对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯，它们都是强极性化合物，可采用反相液相色谱进行分析，选用非极性的C-18烷基键合相作固定相，甲醇的水溶液作流动相。
在一定的色谱条件下，酯类各组分的保留值是恒定的，因而在同样条件下，记录纯酯类各组分和未知样品的色谱图，将测得的未知样品的各组分保留时间与已知纯酯类各组分保留时间对照，便可确定未知样品中各组分存在与否。这种利用纯物质对照定性分析的方法适用于来源已知且组分简单的混合物。
本实验采用归一化法定量。归一化法适用条件及计算公式与气相色谱法相同：
Ci（%）=(fiAi)/(ΣfiAi)
在对羟基苯甲酸酯类混合物属同系物，具有相同的生色团和助色团，因此紫外光度检测器测量时，它们的校正因子相同，故上式便可检测为
Ci（%）=Ai/ΣAi×100％
三、仪器和试剂
仪器：高效液相色谱仪LC-20aT
试剂：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、甲醇、水（GB/T 6682规定的一级水）、乙酸铵（分析纯）
实验条件
1 色谱柱：长15cm、内径3mm，装填C-18烷基键合相、颗粒度为10um的固定相。
2 流动相：甲醇+20mmol/L乙酸铵溶液=60+40（体积比）。
3 检测器：紫外光度检测器，检测波长扫描范围 210nm—400nm， 定量波长256nm。
4 进样量：10uL。
四、实验步骤
1、溶液的配制
标准储备液：分别于4个100mL容量瓶中，配制浓度为1000ug/mL的上述4种酯类化合物的甲醇溶液。分别称取4种酯类0.1000g于50mL烧杯中溶解然后定容到100mL容量瓶中。
标准工作液：分别取上述4种标准储备液于4个10mL比色管中，配制浓度均为10ug/mL的4种酯类化合物的甲醇溶液，摇匀备用。
取5mL浓度为1000ug/mL的上述4种酯类化合物的甲醇溶液稀释到100mL容量瓶中得浓度为50ug/mL的4种酯类化合物的甲醇溶液；分别取2mL浓度为50ug/mL的上述4种酯类化合物的甲醇溶液于10mL比色管中定容得到10ug/mL的标准工作液。
标准混合工作液：在一个10mL的比色管中，分别取2mL浓度为50ug/mL的4种酯类化合物的甲醇溶液定容得到浓度均为10 ug/mL的酯类混合的甲醇溶液，混匀备用。
2、实验操作
（1）将配制好的流动相甲醇水溶液置于超声波发生器上，脱气5min。
（2）根据实验条件，按照仪器说明书操作步骤将仪器调节至进样状态，待仪器液路和电路系统达到平衡，记录仪基线呈平直时，即可进样。
（3） 依次分别吸取10uL四种标准工作液、标准混合工作液和未知试液进样，记录各色谱图，并各重复两次。
五、数据及处理
⒈记录实验条件，保存实验资料。
⒉测量4种在对羟基苯甲酸酯类化合物色谱图的保留时间tR,并填于下表中。
组分 | tR/min | |||
1 | 2 | 3 | 平均 | |
对羟基苯甲酸甲酯 | ||||
对羟基苯甲酸乙酯 | ||||
对羟基苯甲酸丙酯 | ||||
对羟基苯甲酸丁酯 | ||||
⒊一次测量标准混合物色谱图上各色谱峰的保留时间tR，然后与上表tR中对照。确定各色谱峰为何种化合物所产生，填于下表中。
色谱峰 | tR/min | 相应化合物的名称 | |||
1 | 2 | 3 | 平均值 | ||
峰1 | |||||
峰2 | |||||
峰3 | |||||
峰4 | |||||
⒋测量未知试样色谱图上各组分的峰高h、峰宽Y，计算各组分峰面积A及其含量c i（%），并将数据列于下表中。
组分 | 次数 | h/mau | Ymin | A/mau*s | 平均Ai / mau*s | 平均ci/% |
对羟基苯甲酸甲酯 | 1 | |||||
2 | ||||||
3 | ||||||
对羟基苯甲酸乙酯 | 1 | |||||
2 | ||||||
3 | ||||||
对羟基苯甲酸丙酯 | 1 | |||||
2 | ||||||
3 | ||||||
对羟基苯甲酸丁酯 | 1 | |||||
2 | ||||||
3 | ||||||
六、注意事项
⒈对色谱柱来说，在通常的分析条件下，可长时间使用，但如发生杂物吸附或由微粒引起的堵塞时，则其性能大大降低，为延长色谱柱寿命建议使用保护柱。
⒉若直接注入浑浊的试样或含有微粒的试样，则会成为流路或色谱柱堵塞的原因，请用0.2～0.5um左右的圆盘过滤或离心沉淀来去除杂物。
⒊在流动相水溶液中含有眼睛所看不到的很多离子及微生物，如在此状态下直接使用时，则会造成过滤器及色谱柱的堵塞以至压力上升或色谱柱劣化，无法进行良好的分析，建议将流动相水溶液用0.22um的膜滤器减压过滤后使用。
⒋压力不能太大,最好不要超过30Mpa,防止过高压力冲击色谱柱。
⒌每次使用后要冲洗干净进样阀中残留的样品和缓冲盐,防止无机盐沉积和样品微粒磨损阀转子;使用完毕后须在记录本上记录使用情况。
⒍色谱柱若不用,在卸下前必须洗去缓冲液,并用大于10%的有机溶剂充满整个色谱柱,卸下柱后,用柱堵头将色谱柱首尾密封。
七、思考题
⒈高效液相色谱用于哪些物质的测定？
⒉高效液相色谱的基本检测原理是什么？
⒊在高效液相色谱中，为什么可以利用保留值定性？这种定性方法可靠吗？
本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/75dc08aa011ca300a7c390b5.html
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