细胞免疫荧光步骤

方法一：

1. 首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片）

2. 然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1－2分钟使细胞膜通透。

3. 接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。

4. 剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。

5. 接下来二抗孵育步骤同上。

6. 最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上去（细胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。

7. 抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。

8. 双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。

方法二：

1. 选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记 的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。

2. 我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过 夜比较好，背景比较清晰。

3. 我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。

4. 封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。

5. 其余步骤同一般免疫荧光单标操作。

方法三：

1. 片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色

2. 细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片

3. 细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。

4. 其实小的well的话，可以直接拿来染色，没问题的。

5. 固定：用PBS洗去培养液，用固定液（如甲醇和丙酮；4%多聚甲醛；酒精。。。）固定细胞。

6. 内源性过氧化物酶处理，3%过氧化氢处理细胞（选作，二抗连HRP得必做，其他的如做免疫荧光染色不用做）。

7. 通透（胞浆蛋白和细胞核蛋白需要做；细胞膜蛋白不需要做），一般选用Triton-X100来做细胞通透，浓度和时间需要摸索，一般是0.1-5%，处理时间为1-30分钟，级个别需要到1-2小时。

8. 封闭：洗去通透液，用二抗同源的血清约10%的浓度in PBS中封闭半小时，也可以选用5-10%脱脂奶粉。封闭结束后千万不要洗，直接上一抗。

9. 一抗：具体你想做什么样的蛋白，咨询抗体公司如santa cruze,Abcam,sigma....。选取具体的抗体，但是一抗的稀释浓度也是要摸索，抗体稀释液可以购买抗体公司现成的，对于新手还是挺好的。时间一般是4度过夜或者37度1小时。一抗最好还是选用外国抗体公司的抗体。

10. 洗去一抗。

11. 上二抗，二抗一般抗体公司会给你推荐的，你在其中选上一个就行了，自己选国产的也行，就是选在哪个动物体内做的一抗，二抗就选抗那个动物的就行了。二抗的浓度也是需要摸索的，抗体稀释液和一抗相同就行了。二抗的时间一般是37度半小时。

12. 底物显色（选作，二抗连得是酶的必做，按试剂盒的说明书添加就行了，显色时间可能需要摸索，以免显色过度引起假阳性；二抗连得是荧光报告的不用做）

13. 洗去二抗，染核

14. DAPI或者Hoechst染核

15. 洗去染核液，加PBS，上镜观察。

方法四：

(1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm，5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

(2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5 min。

(3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min。通透后用PBS洗涤3×5 min。

(4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min。

(5) 一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min。

(6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h。PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。

(7) 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。

方法五：

1． 漂洗血清蛋白PH7.2-7.4，37度 PBS 2小时.

2． -20度甲醇固定20分钟后，自然、干燥 10分钟

3． PBS洗净：3min＊3

4． 1%Triton：25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS

5． PBS洗净：2＊5min

6． 羊血清封闭：37度，20分钟

7． 一抗，4度过夜，一般要大于18小时或者37度1-2小时

8． 4度 PBS洗净，３min＊5次

9． 二抗　37度小于一小时

10． 37度　PBS洗净，3＊3min

11． 凉干封片（封闭液PH8.5）　　

细胞免疫荧光步骤：

1.细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗衣粉洗干净，用水冲静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再烤箱中大约8小时烤干备用。

爬片可以在培养皿 六孔板或24孔板中都可，我选择在培养皿中爬。一为节约经费（培养皿可以重复利用）二来觉得培养皿口大，操作比较方便。培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镊子 

具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量）

取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。最后盖上培养皿置于37度5％CO2的暖箱中培养，根据细胞生长状况，24小时或更长时间适时取出爬片。

爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4％多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。

将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了 做好的细胞爬片可以放在－20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。

2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)；

3.PBS漂洗5min；

4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理)；

5.PBS漂洗2次，每次5min；

6.1%BSA封闭30min；

7.加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h；

8.PBS漂洗2次，每次5min；

9.加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h；

10.PBS漂洗2次，每次5min；

11.5ug/ml DAPI染色2min；

12.抗淬灭封片剂封片。

抗淬灭封片剂:

2.5% DABCO (w/v)

50mM Tris(pH8.0)

90%甘油

细胞免疫荧光

细胞爬片

4%多聚甲醛固定10min

(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮)

PBS漂洗5min

0.5% Triton 穿孔15min

(丙酮固定法不用透化处理)

PBS漂洗2次，每次5min

1%BSA封闭30min

加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h

PBS漂洗2次，每次5min

加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h

PBS漂洗2次，每次5min

5ug/ml DAPI染色2min

抗淬灭封片剂封片

2.5% DABCO (w/v)

抗淬灭封片剂 50mM Tris(pH8.0)

90%甘油

0.25g DABCO

9ml甘油

0.5ml 1M Tris(Ph8.0) 70℃溶解，-20℃保存

0.5ml ddH2O

本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/776f91708e9951e79b892727.html