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制备感受态细胞的原理和方法
制备感受态细胞的原理和方法
发布时间:2023-08-18 05:03:56 来源:
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制备感受态细胞的原理和方法
1
、感受态细胞的概念
重组
DNA
分子体外构建完成后,必须导入特定的宿主(受体)细胞,使之无性繁殖
并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组
DNA
分子
的转化。
在原核生物中,转化是一个较普遍的现象,在细胞间转化是否发生,一方面取决于供
体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系,另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态
有着很大的关系。
所谓的感受态,即指受体(或者宿主)最易接受外源
DNA
片段并实现其转化的一种
生理状态,
它是由受体菌的遗传性状所决定的,
同时也受菌龄、
外界环境因子的影响。
cAMP
可以使感受态水平提高一万倍,而
Ca
2+
也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现
在对数生长期,新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积
15%
的无菌甘油或
-70
℃保存(有
效期
6
个月)
。
二原理
在基因克隆技术中,
转化特指将质粒
DNA
或以其为载体构建的重组
DNA
导入细菌体
内,
使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领
域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法(如:电击法,
CaCl
2
等化学试剂法)处理后,使细胞膜
的通透性发生变化,
成为能容许外源
DNA
分子通过的感受态细胞。
进入细胞的
DNA
分子
通过复制、表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
化学制备法:
大肠杆菌的转化常用化学法
(
CaCl
2
法)
,
该法最先是由
Cohen
于
1972
年发现的。
其
原理是细菌处于
0
℃,
CaCl
2
的低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的
DNA
形
成抗
DNase
的羟基
-
钙磷酸复合物粘附于细胞表面,
经
42
℃短时间热冲击处理,
促使细胞
吸收
DNA
复合物,在丰富培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增值,被转化的
细菌中,重组子中基因得到表达,在选择性培养基平板上,可选出所需的转化子。
Ca
2+
处理的感受态细胞,其转化率一般能达到
5×10
6
~2×10
7
转化子
/ug
质粒
DNA
,
可以满足一般的基因克隆试验。
如在
Ca
2+
的基础上,
联合其它的二价金属离子
(如
Mn
2+
、
Co
2+
)
、
DMSO
或还原剂等物质处理细菌,则可使转化率提高
100~1000
倍。
化学法简单、
快速、
稳定、
重复性好,
菌株适用范围广,
感受态细菌可以在
-70
℃保存,
因此被广泛用于外源基因的转化。
物理制备法:
电转法
(原理待续除化学法转化细菌外,
还有电击转化法,
电击法不需要预先诱导细
本文来源:
https://www.2haoxitong.net/k/doc/a14e0f13a216147917112874.html
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