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免疫荧光步骤
免疫荧光步骤
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一.
细
胞免疫荧光步骤:
1.
取出细胞爬片放到
35mm
或
60mm
用过的细胞培养皿里,
PBS
洗三遍。
注意:有的时候作的细胞爬片可能比较小,因此夹取的时候要小心,注意
反正面,放
在皿里洗比较方便,避免了来回夹取,另外洗的时候加
PBS
不要太冲,不要细胞冲下
来。洗的时候我都是多加
PBS
,稍晃一下就倒掉,没有等
5
分钟或
10
分钟。
2. 4
%冷的多聚甲醛固定
20
分钟,
PBS
洗三遍。
3. 0.2
%
Triton X
-
100
通透
10
分钟,
PBS
洗三遍。
4.
与二抗相同宿主的血清封闭
30
分钟,
PBS
洗三遍。
5.
一抗
4
度湿盒内过夜,也可
37
度
2
小时,感觉前者效果好,
PBS
洗三遍。
6.
二抗室温
2
小时(避光)
,或者
37
度
1
半小时,
PBS
洗三遍。
7.
最好用
DAPI
染核,然后直接照荧光片。
8.
蒸馏水洗掉
PBS
,甘油封片,指甲油封片子的四周,盖上盖玻片,显微镜下拍照。
二.
大鼠颈动脉组织做免疫荧光。具体步骤是:
1.
生理盐水心脏灌注清洗。取颈动脉,预冷的
4%
甲醛固定过夜后,
30%
蔗糖
PBS
沉底。
2.OCT
包埋,放
-20
°
c
,短期内冰冻切片
6um
,
-80
°
c
保存
3.
取出切片立即
0.01M PBS
洗
5min x 3
次(下同
5.0.2%PBST (Triton X
-
100
室温通透
8min
,
PBS
洗
3
次
6.5%
正常驴血清
+0.02%PBST
室温封闭
30min(
二抗是驴来源
7.
吸掉血清,直接加一抗
0.02%PBST
液
(1:500
,
4
°
c
过夜
8.
室温复温
15min
,
PBS
洗
9.
加二抗,
37
°
c
恒温箱孵育
50min
10.
直接加
DAPI
孵育
10min
11.
摇床
PBS
洗
10min x 3
次
12.
甘油封片,共聚焦拍照。
本文来源:
https://www.2haoxitong.net/k/doc/b64100e21b37f111f18583d049649b6648d709d9.html
《免疫荧光步骤.doc》
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