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正在进行安全检测...
正在进行安全检测...
发布时间:1714345888 来源:
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基因表达检测的最终技术目标是能确定所关注的任何组织、
细胞
的
RNA
的绝对表达量。
可以先从样本中抽提
RNA
,
再标记
RNA
,
然后将这些标记物作探针和芯片杂交,
就可得出原始样本中不同
RNA
的量。
然而用于杂交的某个特定基因的
RNA
的量和在一个
相应杂交反应中的信号强度之间的关系十分复杂,
它取决于多种
因素,包括标记方法、杂交条件、目的基因的特征和序列。所以
芯片的方法最好用于检验两个或多个样本中的某种
RNA
的相对
表达量。
样本之间某个基因表达的差异性
(包括表达的时间、
空
间特性及受干扰时的改变)是基因表达最重要的,而了解
RNA
的绝对表达丰度只为进一步的使用或多或少地起一些作用。
基因表达的检测有几种方法。
经典的方法
(仍然重要)
是根据在
细胞或生物体中所观察到的生物化学或表型的变化来决定某一
特定基因是否表达。
随着大分子分离技术的进步使得特异的基因
产物或蛋白分子的识别和分离成为可能。随着重组
DNA
技术的
运用,
现在有可能检测.
分析任何基因的转录产物。
目前有好几
种方法广泛使用于于研究特定
RNA
分子。这些方法包括原位杂
交.
NORTHERN
凝胶分析.打点或印迹打点.
S
-
1
核酸酶分
析和
RNA
酶保护研究。这里描述
RT-PCR
从
RNA
水平上检查
基因表达的使用。
8 f3 f- |2 L K b7 ]- ~- |
RT-PCR
检测基因表达的问题讨论
关于
RT-PCR
技术方法的描述参见
PCR
技术使用进展,在
此主要讨论它在使用中的问题。
理论上
1μL
细胞质总
RNA
对稀
有
mRNA
扩增是足够了
(每个细胞有
1
个或几个拷贝)
。
1μL
差
不多相当于
50
-
100
,
000
个典型哺乳动物细胞的细胞质中所含
RNA
的数量,靶分子的数量通常大于
50
,
000
,因此扩增是很
容易的。该方法所能检测的最低靶分子的数量可能和通常的
DNAPCR
相同;例如它能检测出单个
RNA
分子。当已知量的
转录
RNA
(用
T7RNA
聚合酶体外合成)经一系列稀释,实验
结果表明通过
PCR
的方法可检测出
10
个分子或低于
10
个分子,
这是反映其灵敏度的一个实例。用此技术现已从不到
1
个
philadelphia
染色体阳性细胞株
K562
中检测到了白血病特异的
MRNA
的转录子。因此没必要分离
polyA+RNA
,
RNA/PCR
法
有足够的灵敏度来满足绝大多数实验条件的需要。
7 H+ F& _* S6 W( a8 p: [, @- d, {
将
PCR
缓冲液同时用于反转录酶反应和
PCR
反应,可简
化实验步骤。我们发现整个反应过程皆用
PCR
缓冲液的结果相
当于或优于先用反转录缓冲液合成
CDNA
,然后
PCR
缓冲液进
行
PCR
扩增循环。当然,值得注意的是
PCR
缓冲液并不最适
合第一条
DNA
链的合成。
我们对不同的缓冲液用于大片段
DNA
合成是否成功还没有进行过严格的研究。
反转录酶的选择似乎对实验方法成功和否并不十分重要。
本文来源:
https://www.2haoxitong.net/k/doc/c5025e2bc67da26925c52cc58bd63186bdeb9208.html
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