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大肠杆菌感受态细胞的制备和转化(原理)
感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后,必须导入特定的宿主(受体)细胞,使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。在原核生物中,转化是一个较普遍的现象,在细胞间转化是否发生,一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系,另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。1、感受态细胞的概念
所谓的感受态,即指受体(或者宿主)最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态,它是由受体菌的遗传性状所决定的,同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍,而CaT也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期,新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油或-70C保存(有效期6个月)。2、转化的概念及原理
在基因克隆技术中,转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内,使之获得新的遗传特性的一种方法。
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它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法(如:电击法,CaCl2等化学试剂法)处理后,使细胞膜的通透性发生变化,成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
大肠杆菌的转化常用化学法(CaCl2法),该法最先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌处于OC,CaCb的低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA形成抗DNase(DNA酶)的羟基--钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42C短时间热冲击处理,促使细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增值。被转化的细菌中,重组子中基因得到表达,在选择性培养基平板上,可选出所需的转化子。
Cf处理的感受态细胞,其转化率一般能达到5X10--2x10转化子/质粒DNA可以满足一般的基因克隆试验。如在CsT的基础上,联合其它的二价金属离子(如Mn、C6)、DMS(或还原剂等物质处理
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细菌,则可使转化率提高1OO--1OOO倍。
化学法简单、快速、稳定、重复性好,菌株适用范围广,感受态细菌可以在-70C保存,因此被广泛用于外源基因的转化。
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除化学法转化细菌外,还有电击转化法,电击法不需要预先诱导细菌的感受态,依靠短暂的电击,促使DNA进入细菌,转化率最高能达到10