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· １６Ｏ８· 西部医学２０１３年ｌ１月第２５卷第１１期 Ｍｅｄ Ｊ Ｗｅｓｔ Ｃｈｉｎａ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１３，Ｖｏ１．２５，Ｎｏ．１１ 不同固定方法对细胞免疫荧光染色结果的影响 ＊ 李 冉，杨文理，覃 扬，魏玲，沈文燕，刘秋英，俞小琴 （四川大学华西基础医学与法医学院生物化学与分子生物学教研室，四川成都６１００４１） 【摘要】 目的 比较不同的固定方法对细胞内胞浆蛋白Ｖｉｇｉｌｉｎ和核蛋白ＣＴＣＦ的免疫荧光染色结果的影响。方 法在免疫染色前，分别采用四种方法对ＨｅｐＧ２细胞进行固定及通透：①纯甲醇一２Ｏ℃处理８ｍｉｎ后，再用８Ｏ 丙酮一 ２Ｏ℃处理１ｍｉｎ。②甲醇：丙酮的１：１混合溶剂一２Ｏ℃处理１０ｍｉｎ。③在方案２的基础上，再用０．１ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ一１。０冰上 通透１０ｒａｉｎ。④４ 多聚甲醛室温固定１０ｍｉｎ后，用０．１ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ一１００冰上通透１０ｍｉｎ。结果采用方案①、②、③、④ 得到的胞浆蛋白ｖｉｇｉｌｉｎ在细胞内的大致分布无明显差异，但用方案④处理后，染色效果更为清晰而能更好地观察到细 胞的细微结构；另外，采用方案①和方案②处理细胞后，对核蛋白ＣＴＣＦ进行免疫染色，可见ＣＴＣＦ分布于胞浆；方案③ 中，在纯甲醇固定后，若用０．１ Ｔｒｉｔｏｎ—Ｘ—１００通透，则ＣＴＣＦ显示主要分布于细胞核内，胞质内亦有阳性染色；方案④的 通透条件下，ＣＴＣＦ特异性分布于细胞核，胞质内几乎无阳性染色。结论响很大，应针对抗原特点，采用适宜的固定方法，以得到正确的实验结果。 【关键词】 固定方法；免疫荧光；胞浆蛋白；核蛋白 【中图分类号】Ｒ－３３１；Ｒ ４４６．６１ 【文献标识码】Ａ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２—３５１１．２０１３．ＩＩ．００３ 不同的固定及通透方法对免疫染色的结果影 Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｉｘａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ＬＩ Ｒａｎ，ＹＡＮＧ Ｗｅｎ。Ｉｊ，ＱＩＮ Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｅｓｔ Ｃｈｉｎａ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｓｉｃｈｕａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｉｃｈｕａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ ６ １００４ １） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｉｘａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｎ ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ ｏｆ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｐｒｏ— ｔｅｉｎ Ｖｉｇｉｌｉｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ＣＴＣＦ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｆｉｘｅｄ ａｎｄ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ ｂｙ ｆｏｕｒ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ：①ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｓｏａｋｅｄ ｉｎ ｐｕｒｅ ｍｅｔｈａｎｏｌ ｆｏｒ ８ｍｉｎ ａｔ一２０￣Ｃ ａｎｄ ｉｎ ａｃｅｔｏｎｅ ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｆｏｒ Ｉｍｉｎ ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅｌｙ；②Ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｓｏａｋｅｄ ｉｎ ｔｈｅ １：１ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ ｍｅｔｈａｎｏｌ ａｎｄ ａｃｅｔｏｎｅ ｆｏｒ １０ ｒａｉｎ，一２Ｏ℃．③Ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄ②，ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｐｅｒｍｅａｂｌｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ０．１ Ｔｒｉｔｏｎ—Ｘ一１００ ｏｎ ｉｃｅ．④Ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｆｉｘｅｄ ｂｙ ４ ＰＦＡ，ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｂｅｉｎｇ ｐｅｒｍｅａｂｌｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ０．１ Ｔｒｉｔｏｎ—Ｘ一１００ ｏｎ ｉｃｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅｒｅ ｉｓ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｇｉｌｉｎ ｂｙ ｍｅｔｈｏｄｓ①一④，ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｓｕｂｔｌｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｍｅｔｈｏｄ④．Ｂｅｓｉｄｅｓ，ＣＴＣＦ ｗｅｒｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｉｎ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄｓ①ｏｒ②．Ａｓ ｉｎ ｍｅｔｈｏｄ③，ｉｆ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｄ ｂｙ ０．１ ＡＴｒｉ０ｔｏｎ—Ｘ—ｉ００ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｆｉｘａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｒｅ ｍｅｔｈａｎｏ１．ＣＴＣＦ ｗｅｒｅ ｍａｊｏｒｌｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉ ｗｉｔｈ ｌｅｓｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｉ
