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正在进行安全检测...
正在进行安全检测...
发布时间:1714341765 来源:
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基因表达谱分析技术
1
、微阵列技术(
microarray
)
这是近年来发展起来的可用于大规模快速检测基因差别表达、基因组表达谱、
DNA
序
列多态性、
致病基因或疾病相关基因的一项新的基因功能研究技术。
其原理基本是利用光导
化学合成、照相平板印刷以及固相表面化学合成等技术
,
在固相表面合成成千上万个寡核苷
酸“探针”(
cDNA
、
ESTs
或基因特异的寡核苷酸)
,并与放射性同位素或荧光物标记的来
自不同细胞、组织或整个器官的
DNA
或
mRNA
反转录生成的第一链
cDNA
进行杂交,然
后用特殊的检测系统对每个杂交点进行定量分析。
其优点是可以同时对大量基因,
甚至整个
基因组的基因表达进行对比分析。
包括
cDNA
芯片
(
cDNA microarray
)
和
DNA
芯片
(
DNA
chips
)
。
cDNA
芯片使用的载体可以是
尼龙膜
,也可以是
玻片
。当使用尼龙膜时,目前的技术
水平可以将
20000
份材料点在一张
12cm×18cm
的膜上。
尼龙膜上所点的一般是编好顺序
的变性了的双链
cDNA
片段。要得到基因表达情况的数据,只需要将未知的样品与其杂交
即可。
杂交的结果表示这一样品中基因的表达模式,
而比较两份不同样品的杂交结果就可以
得到在不同样品中表达模式存在差异的基因。
杂交使用的探针一般为
mRNA
的反转录产物,
标记探针使用
32PdATP
。如果使用玻片为载体,点阵的密度要高于尼龙膜。杂交时使用两
种不同颜色的荧光标记不同的两份样品,
然后将两份样品混合起来与一张芯片杂交。
洗去未
杂交的探针以后,能够结合标记
cDNA
的点受到激发后会发出荧光。通过扫描装置可以检
测各个点发出荧光的强度。
对每一个点而言,
所发出的两种不同荧光的强度的比值,
就代表
它在不同样品中的丰度。
一般来讲,
显示出来的图像中,
黄色的点表示在不同的样品中丰度
的差异不大,红色和绿色的点代表在不同样品中其丰度各不相同。使用尼龙膜为载体制作
cDNA
芯片进行研究的费用要比玻片低,因为尼龙膜可以重复杂交。检测两种不同的组织
或相同组织在不同条件下基因表达的差异,
只需要使用少量的尼龙膜。
但是利用玻片制作的
cDNA
芯片灵敏度更高,而且可以使用
2
种探针同时与芯片杂交,从而降低了因为杂交操
作带来的差异;缺点是无法重复使用还必须使用更为复杂的仪器。
Guo
等(
2004
)将包含
104
个重组子的
cDNA
文库点在芯片上,用于检测拟南芥叶
片衰老时的基因表达模式,得到大约
6200
差异表达的
ESTs
,对应
2491
个非重复基因。
其中有
134
个基因编码转录因子,
182
个基因预测参与信号传导,
如
MAPK
级联传导路径。
Li
等(
2006
)设计高密度的寡核苷酸
tiling microarray
方法,检测籼稻全基因组转录表达
情况。芯片上包含
13,078,888
个
36-mer
寡核苷酸探针,基于籼稻全基因组
shot-gun
测
序的序列合成,
大约
81.9%
(
35,970
)
的基因发生转录事件。
Hu
等
(
2006
)
用含有
60,000
寡核苷酸探针
(代表水稻全部预测表达基因)
的芯片检测抗旱转基因植株
(过量表达
SNAC1
水稻)中基因的表达情况,揭示大量的逆境相关基因都是上升表达的。
2
、基因表达系列分析(
Serial analysis of gene expression, SAGE
)
基因表达系列分析
(
SAGE
)
是一种转录物水平上研究细胞或组织基因表达模式的快速、
有效的技术,
也是一种高通量的功能基因组研究方法,
它可以同时将不同基因的表达情况进
行量化研究(
Velculescu et al., 1995
)
。
SAGE
的基本原理是:每一条
mRNA
序列都可以
用它包含的
9bp
的小片段(
TAG
)代替,因此考查这些
TAGs
出现的频率就能知道每一种
mRNA
的丰度。
首先利用生物素标记的
oligo
(
dT
)
引物将
mRNA
反转录成双链
cDNA
,
然后利用
NlaIII
酶切双链
cDNA
。
NlaIII
酶的识别位点只有
4bp
,因此
cDNA
都被切成几
十
bp
的小片段。
带有生物素标记的小片段
cDNA
被分离出来,
平均分成
2
份。
这
2
份
cDNA
分别跟
2
个接头连接,
2
个接头中均有一个
FokI
酶切位点。
FokI
是一种
II S
型核酸内切酶,
其识别位点不对称,切割位点位于识别位点下游
9bp
且不依赖于特异的
DNA
序列。
FokI
酶切分成
2
份的
cDNA
之后,
带有部分接头序列的
TAGs
就被释放下来。
这时将
2
份
cDNA
本文来源:
https://www.2haoxitong.net/k/doc/e5ddd3a3f524ccbff12184ce.html
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