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Western blot内参选择
Western blot内参选择
发布时间:2020-10-10 来源:
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内参
要检测一个基因的表达产物是否正确,
或者比较表达产物量的相对变化,
首
选方法是
Western
Blot
。因为
Western
Blot
操作相对简单方便,既可以
定性分析
表达产物,同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。
而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物,确实是有一定的
不确定性的。所以,严谨的
Western
Blot
实验设计中要求有良好的参照体系,
对实验结果分析是非常有用。
分子量
Marker
(用来确定蛋白条带对应的分子量大小)
内参即是内部参照
(
Internal Control
)
,
对于哺乳动物细胞表达来说一般是指
由管家基因编码表达的蛋白
(Housekeeping Proteins
,
它们在各组织和细胞中的表
达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在
Western
Blotting
实验中,
除了需要进行蛋白抽提、
蛋白定量、
等量蛋白上样电泳、
转膜、
靶蛋白抗体孵育、
显色等步骤以外,
还需要进行内参的检测,
以校正蛋白质定量、
上样过程中存在的实验误差,保证实验结果的准确性。
Western
Blot
比较不同条件下或者不同组织中,目的蛋白表达量的相对多
少,前提条件是等量的蛋白上样,才有比较的基础,特别表达量不高时,上样量
的差别就很可能影响结果的分析,所以需要内参。
在
Western
Blotting
中使用内参其实就是
在
WB
过程中另外用内参对应的抗
体检测内参
,
这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达,
由于内参在各组
织和细胞中的表达相对恒定,
借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误
差
,
这样半定量的结果才更为可信。
此外使用内参可以作为空白对照,
检测蛋白
转膜情况是否完全、整个
Western Blot
显色或者发光体系是否正常。
在
Western Blotting
实验过程中使用内参的方法通常有以下三种:
第一种是超级简便的标记内参使用法,
只要在二抗孵育时加入
HRP
标记内
参抗体,按照正常操作即可;
第二种是普通内参,当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相
差不大时,可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测,然后使用
Strip
缓冲液
洗掉膜上的抗体,重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。
第三种,当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较
明显情况下,
可以在转膜后预染,
根据蛋白质
Marker
的大小将膜剪为大分子量
和小分子量两部分,使内参蛋白与目的蛋白分开,然后两块膜分别与内参蛋白
抗体以及目的蛋白抗体进行温育,二抗温育以及显色。
常用的蛋白质内参有
GAPDH
(
glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase
)
和细胞骨架蛋白
beta-actin
或
beta-tubulin
。
不同的组织本来就应该选择不同的内
参,不能一概而论
。一
般我们选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差
5KD
以上。因此你要知道你检测的蛋白的分子量来选择合适的内参。
GAPDH
(甘油醛
-3-
磷酸脱氢酶)是参与糖酵解的一种关键酶,而
tubulin
和
actin
类似,是细胞骨架的组成部分,但是不是肌肉的主要成分,应该是一个代
替品。
不同异构体表达对蛋白的检测是有很大的影响,买抗体前要好好熟悉自己
的目的蛋白,很多抗体杂不出条带其实未必是抗体质量的问题。很多公司的内
参抗体是用抗原片段制备的,不同的公司选择的片段不一样。
本文来源:
https://www.2haoxitong.net/k/doc/ebb2e6f791c69ec3d5bbfd0a79563c1ec4dad750.html
《Western blot内参选择.doc》
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