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Western Blot实验常见问题的解决以及内参的选择
Western Blot实验常见问题的解决以及内参的选择
发布时间:2023-04-10 00:19:06 来源:
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W
esternBlot
实验中为什么检测无信号?(白板)
大概总结为一下几类原因:
(
1
)样品中目的蛋白丰度很低,低于实验的检测下限
(
2
)一抗不识别检测物种的蛋白,同时若有阳性参照的话提供阳性对照蛋白,若阳
性对照正常则说明抗体及实验参照没有问题,可能是样本中目的蛋白含量比较低。
(
3
)蛋白降解
(
4
)待测样品的确为阴性;
(
5
)一抗失效;
(
6
)抗原量不足,每泳道蛋白上样量不低于
0.1ug
WesternBlot
实验中为什么检测的结果分子量大小与实际不符?
(
1
)蛋白存在翻译后修饰—比如蛋白的磷酸化,糖基化等,这些都会增加蛋白的分
子量大小。
(
2
)蛋白存在翻译后剪切—比如很多蛋白首先被合成为前体形式,然后通过剪切获
得生物学活性
(
3
)剪接变异体—相同的基因,经过选择性剪接会产生不同分子量大小的蛋白。
>
>
>
>
(
4
)相对电荷—氨基酸的组成
(带电或
不带电)
(
5
)蛋白形成多聚体—比如蛋白二聚体。
为什么
wb
的结果与
QPCR
结果趋势不一样?
(
1
)
WB
反映的是蛋白水平的结果,
qpcr
反映的是基因水平的结果。理论上蛋白水
平与基因水平是一致的,但是
mRNA
的高低不代表其表达蛋白的高低。
也有一些基因可
能在组织样品中没有正常翻译(或发生泛素化修饰,修饰水平不一致)
,这样即使
qpcr
检
测结果有表达,但是若蛋白没有正常翻译的话,
WB
则检测不到目的条带。
为什么检测结果有很多杂带?
(
1
)可能是样品本身体内表达的蛋白具有多种修饰形式如糖基化、磷酸化、乙酰化
等;
(
2
)蛋白降解,导致蛋白分子量降低;
(
3
)蛋白形成多聚体形式;
为什么
WB
检测的背景比较高?
(
1
)可能抗体浓度浓度较高,
(
2
)抗原量较大。
本文来源:
https://www.2haoxitong.net/k/doc/f138d8220b75f46527d3240c844769eae109a32d.html
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