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龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn 关于真核细胞常用几种基因表达检测方法的比较
作者：张伟 邹若男
来源：《时代经贸》2011年第12期
【摘要】目前国际上对真核细胞基因的表达调控机制研究的已经相当深入了，相对应得对基因表达的产物的检测也逐渐多了起来。首先基因表达的最终产物分为RNA和蛋白质。所以所有的检测方法都是以此为基础进行的。其中以RNA为检测底物的方法有：RT-PCR，Northern blot等。以蛋白质为检测的底物的方法有：ELESA，Western blot，免疫组化等。各种方法有其适用范围及优缺点，本文就其最新进展及常用方法作一个阐述及总结。 【关键词】RT-PCR；Northern blot；ELISA；Western blot；免疫组化
真核细胞比原核细胞复杂的多，基因表达调控机制也不一样。以介绍常用的真核细胞基因表达的检测方法来引导读者更深层次的理解真核细胞基因表达的复杂性。更加全面得理解真核细胞的复杂隔室结构与其基因表达的关系。及解决一些实验过程中常见的错误。 1.以RNA为底物的检测方法
1.1 RT-PCR RT-PCR为反转录RCR（reverse transcription PCR）的缩写。逆转录PCR，或者称反转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR），是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。
在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。由一条RNA单链转录为互补DNA（cDNA）称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖RNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。试剂为：oligo多聚体，相当于mRNA引物，AMV（M-MLV）：逆转录酶dNTP：脱氧核苷酸，RNase：RNA酶抑制剂，PCR Buffer：RT-PCR缓冲液，MgCl2：2价镁离子。
高志强等用荧光RT2PCR快速检测狂犬病病毒，得到方便实用的检测狂犬病病毒的方法。姚立等运用RT-PCR检测一种香菇病毒，并为香菇快速脱毒提供技术支持，是的香菇人工栽培更加周期减短，产量增加，更加有利于抢占国内国际市场。黄一等建立起了用RT-PCR检测食
龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn 品中的骨髓灰质炎病毒的体系，为食品出入境检测提供了现实可行的检测体系。董雅凤等通过RT-PCR建立起了检测苹果茎痘病毒的方法。以上通过RT-PCR在真核生物检测病毒基因的表达都有很明显的检测结果，对其研究的深入，必将带来更加方便实用的检测方法。但RT-PCR过程中的引物要特异的合成，RNA易被无处不在的RNAase水解。而且操作时酶易因反复冻融而变性所以此项检测方法有一定的难度。但因其敏感度高所以也使得其使用率相当高。
1.2 Northern blot Northern blot是在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。用于检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。需要的贵重仪器为：电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，UV交联仪，杂交炉，分光光度计。而且还需要特意的探针模板DNA（25ng），尼龙膜等。还要X光底片，底片暗盒等特异的装置。在进行northern blot之前要用RNAZaP去除梳子，电泳槽，刀片等表面的RNase酶以防污染。基本步骤为：（1）制胶；（2）探针的制备；（3）RNA样品的制备；（4）电泳；（5）转膜；（6）杂交；（7）洗膜；（8）曝光，即成。 汪吉宝等运用Northern blot检测喉鳞状细胞癌中表皮生长因子受体mRNA的表达。辅助阐明鳞状细胞癌发病机制。叶铃等创造性的运用多寡核苷酸探针同步标记应用于Northern blot多基因分析，从而简化了实验过程，缩减了实验时间，节省了实验试剂，并使各基因表达丰度之间的比较具有更高的准确性，提高了Northern blot的检测效率和成功率。廖和荣等报道了运用Northern blot分析绵羊皮肤mRNA差异，一定程度上探讨了与绵羊毛性状相关基因的表达调控机制，从而进一步加快对绵羊羊毛品质改良和提高方面的研究。刘红等创造性的运用反向Northern blot技术快速筛选阳性克隆，可用于各种分离差异片段的方法中差异片段的初步筛选，也可用于基因诊断中的目的基因的多个位点突变的检测，不仅快速而且简便又经济。 以上对Northern blot的灵活运用，既达到了检测的目的又简便经济。但在具体操作过程中应注意：用于RNA电泳、转膜的所有器械、用具均须处理以除去RNAse酶，以免样品的降解。由于RNA分子都比较小，一般不酶切，可以直接将提出的RNA样本点样，转印杂交。应该尽可能使用严谨的杂交条件，比如高的退火温度或高甲酰胺含量。转膜时，注意膜和多孔渗水屏之间不要有气泡.只有细胞内表达量有一定高时才能检测的到，所以灵敏度没有RT-PCR强，并且易污染，因而使用频率不如RT-PCR。 2.以蛋白质为底物的检测方法
2.1 ELISA ELISA（enzyme linked immunosorbent assay
