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正在进行安全检测...

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细胞爬片、固定及免疫荧光的操作步骤
1. 爬片的准备
1 爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；用盖玻片时，可根据自己的需要用小砂轮或玻璃刀剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；
2 将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，然后置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍，放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后高压消毒。高压消毒后取出放入烘箱中烘干，烘干后可放入超净台中备用。
3 可将爬片用多聚赖氨酸处理，以使细胞与爬片结合更牢固。1mg/ml的多聚赖氨酸用0.22um的滤器过滤除菌后分装于经过无菌处理的1ml细胞冻存管内保存在4℃里，三个月内仍然可以使用。用时将高压灭菌过的爬片放到0.1mg/ml的多聚赖氨酸溶液内浸泡5min，无菌晾干即可（放入培养板孔内注意爬片的正反面）。或将爬片铺于培养皿中，将多聚赖氨酸溶液滴于爬片上，室温10分钟后，吸除玻片上的溶液，在超静台内晾干后使用。储存、稀释和吸取多聚赖氨酸要使用塑料制品。
2. 细胞爬片
1 胰酶消化细胞后重悬细胞于完全培养基中，充分吹打，使之成单细胞悬液，计数。
2 根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内。滴加细胞悬液时，根据爬片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，然后将爬片置于液滴上，压紧，使爬片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，防止加细胞悬液时爬片漂起，造成双层细胞贴

片。若细胞贴壁能力不强，爬片可经多聚赖氨酸浸片后放入。
3. 细胞的固定及免疫荧光
1 在培养板中培养好细胞后，吸除培养基，一般先使用PBS轻洗细胞2×3 min，然后再做固定（凋亡的TUNEL染色等可以不清洗）。
2 固定：加入4%多聚甲醛(PBS配制固定20分钟。如果暂时不能立即做组化检测，使用含0.4%多聚甲醛的PBS PH7.4浸泡细胞（注意在免疫组化检测完成前不要让细胞变干，否则细胞收缩形态不好）。
3 除去多聚甲醛，使用PBS轻洗细胞3×3 min。
4 通透：0.5%Triton X-100(PBS配制室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）。
5 除去Triton X-100，使用PBS轻洗细胞3×3 min。
6 内源性过氧化物酶处理：3% H2O2孵育15 min（选作，二抗连HRP必需做，其他的如做免疫荧光染色不用做）。
7 除去H2O2，使用PBS轻洗细胞3×3 min。
8 封闭：用10%的与二抗同源的血清(PBS配制封闭半小时。封闭结束后千万不要洗，直接上一抗。

本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/61eec7341cd9ad51f01dc281e53a580217fc507b.html

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