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感受态细胞制备

发布时间：2023-04-07 09:32:27 来源：文档文库

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感受态细胞制备
一、实验目的
1、掌握氯化钙法制备感受态细胞的原理、方法和技术；
2、掌握电转化感受态细胞的制备原理及方法；
3、学习并掌握感受态细胞效价的检测方法。
二、实验原理
在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标记基因，并在一定的培养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因。细菌吸收外源DNA的能力最高时的状态被称为感受态细胞。有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时，才会处于感受态,如大肠杆菌。大肠杆菌的感受态细胞制备原理是取对数生长期的细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达。对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转化。电激转化的效率往往比化学法高出1到2个数量级，达到1 x 108转化子每1μg DNA，甚至1 x 109转化子每1μg DNA，所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选

化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。
物理制备法：
电转法，除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109 ~ 1010转化子/μg闭环DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：

转化总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积

转化率（转化子数／每μg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(μg 理论上转化率最高为每微克地标准质粒转化的菌落数为1*1010
三、实验材料
实验仪器：恒温振荡仪、恒温培养箱、低温常速离心机、移液枪、锥形瓶、离心管、LB液体培养基、
实验试剂：0.1M CaCl2溶液、含10%甘油的0.1M CaCl2溶液、GYT、三蒸水、10%甘油的水溶液、DH5α、Top10、DE3、BL21、液氮、冰水。

本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/72dcb32d83c4bb4cf7ecd194.html