制备感受态细胞的实验报告

制备感受态细胞的实验报告

一、 实验目的

掌握制备化学感受态细胞和电转化感受态细胞的方法和步骤。

二、 实验原理

1.感受态细胞的概念

重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。

    在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。

    所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。

    制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。

在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，

使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。

     受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

化学制备法：

   大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。

Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100~1000倍。

化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。

物理制备法：

   电转法  （原理待续除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。

效价的计算公式：

三、 实验步骤

1. 菌种活化

菌种保存在—70度的超低温冰箱

2. 前培养

将单菌落接种到10ml的培养液中，在恒温振荡器37°下过夜培养

3. 培养基的制备

200ml液体培养基：加水150ml于烧杯中，加2g蛋白胨，1g酵母粉，2gNacl定容200ml在磁力搅拌器中搅拌

200ml固体培养基：在液体的基础上，加琼脂3g

在把液体与固体放到高压灭菌锅里 121℃ 20minutes

第二天接种菌液4ml到培养基中在恒温振荡箱中培养一夜

化学方法：（以大肠杆菌感受态制备为例）

1)     测培养液（振荡了一夜的）OD600 若<0.6A(在0.4~0.5之间即可)

2)      每人取50ml 菌液到离心管 4000rpm 4℃ 10 minutes，去上清液

3)     在菌体中加20ml中加0.1mol氯化钙水溶液（目的：将细菌彻底悬浮分散开来）然后冰浴30min 离心

4）倒上清液，加10ml 0.1 mol 氯化钙(10%的甘油)悬浮后离心

5）在收集菌体 加150ml 0.1mol氯化钙悬浮

6）分装（40ml每管）液态冷冻

电 转化

1)    接种：在200ml的LB液体培养基加入1ml的前培养  

2)培养：OD值在 0.4~0.5之间即可 离心后 将已培养好的放到冰里摇晃   

3) 水洗1 加水30~40ml 悬浮 离心 水倒掉

水洗2 加20ml水     离心 水倒掉

水洗3 加10ml水 离心 水倒掉

4)     甘油10%洗2次（每次加5ml）中间离心两次 在第二次加甘油悬浮后离心后加120uLGYT悬浮液

5)       一个人准备4个小管子（每个40uL 扔到液氮速冻 放到-70℃保存）

效价检测：根据加入2uL的菌体液体培养出的菌落数若为N个，则计算效价X的公式推导为N/X=1000/10^10则x=N*10^7

效价：指能用1ug的标准质粒能够转化出的菌落数。

具体步骤

化学效价检测

A.把感受细胞从超低温冰箱中拿出(冰水先准备好再拿出感受态细胞在冰水中慢慢溶化)

B.加1uL标准质粒于40uL的感受细胞中（用手指轻弹）

C.在42℃的干式恒温器90秒 (热休克)

D．再放到冰上2分中 不超过2分

E．之后迅速加入已预热好的37℃LB160uL 复苏45分

F.播盘:2uL （200uL能长10^5个，所以2uL10^3 到达10^6即可用 (50Ul~100Ul 若这里不能长到10^6则不可用)

电转化效价

1. 取Pug19uL加入感受态细胞再将此移到电击杯

2. 下电击杯，让液体到底部

3. 在将电击杯放入电击转化仪电击下，再加入160uL预热好的LB

4. 再用移液枪200多uL从电击杯总吸出放出10mL管中 (封住)

5. 再放到恒温振荡箱60min

四．实验结果

化学检测结果 菌数 4*10^7

电转化检测结果 菌数10^9

五．实验分析

步骤至关重要，在播盘的过程中，注意一些操作，不然会导致实验结果的偏差。

悬浮细胞时要小心，用枪头轻轻吹起细胞即可，否则会影响细菌活性

涂布前玻璃棒要充分冷却，不然会因为温度过高而烫死细菌

涂布时，尽量每个角落都要涂到，在一个角落涂布后，要顺时针90度再涂布，连续转两次

*注意无菌操作

操作过程中要尽量迅速以确保细菌细胞的活性

六．讨论

为了提高转化效率，试验中要考虑一下几个重要因素：

1. 细胞生长状态和密度

2. 质粒的质量和浓度

3. 试剂的质量

4. 防止杂菌和杂DNA的污染

本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/a5b9e14be45c3b3567ec8bd2.html