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免疫荧光细胞化学染色方法
免疫荧光细胞化学染色方法
发布时间:2024-02-18 14:27:21 来源:
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免疫荧光细胞化学染色方法
一、标本制作
可制作涂片、印片、细胞单层培养物、组织切片,经适当固定或不固定,作免疫荧光
染色用。
二、荧光抗体染色方法
(一)直接法
1
.染色
切片经固定后,滴加经稀释至染色效价如
1
:
8
或
1
:
16
的荧光抗体(如兔
抗人
γ
-
球蛋白荧光抗体或兔抗人
IgG
或
IgA
荧光抗体等)
,在室温或
37℃染色
30min
,
切片置入能保持潮湿的染色盒内,防止干燥。
2
.洗片
倾去存留的荧光抗体,将切片浸入
pH7.4
或
pH7.2PBS
中洗两次,搅拌,
每次
5min
,再用蒸馏水洗
1min
,除去盐结晶。
3
.用
50%
缓冲(
0.5mol/L
碳酸盐缓冲液
pH9.0
~
9.5
)甘油封固、镜检
4
.对照染色
①正常免荧光血清染色,
如上法处理切片,
结果应为阴性。
②染色抑制试验
(一步法)
:
将荧光抗体和未标记的抗体球蛋白或血清(相同)等量混合,如上法处理切片。结果应为
阴性。为证明此种染色抑制不是由于荧光抗体被稀释所致,可用盐水代替未标记抗血清,
染色结果应为阳性。此法结果较二步法稳定。③类属抗原染色试验,前面已作叙述。
直接法比较简单,适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、
皮肤的检查和研究。
此法每种荧光抗体只能检查一种相应的抗原,
特异性高而敏感性较低。
(二)间接法
(
1
)
切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上,
置于染色盒中保
持一定的湿度,37℃作用
30min
。然后用
0.01mol/lpH7.2PBS
洗两次,
10min
,用吸水
吸去或吹干余留的液体。
(
2
)
再滴加间接荧光抗体
(如兔抗人
γ
-
球蛋白荧光抗体等)
,
同上步骤,
染色
30min
,
37℃,缓冲盐水洗两次
10min
,搅拌,缓冲甘油封固,镜检。
对照染色:①抗体对照:用正常兔血清或人血清代替免疫血清,再用上法进行染色,
结果应为阴性。②抗原对照:即类属抗原染色,亦应为阴性。③阳性对照。
间接法中上述方法称双层法(
DoubleLayerMethod
)
。另一种称夹心法,即用未标
记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合,再用该抗原之荧光抗体重叠结合
其上,而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在,方法步骤如下:
①切片或涂片固定后,置于染色湿盒内。
②滴加未标记的特异性抗原作用切片于
37℃,
30min
。
③缓冲盐水洗
2
次,每次
5min
,吹干。
本文来源:
https://www.2haoxitong.net/k/doc/b14717281cd9ad51f01dc281e53a580216fc50ee.html
《免疫荧光细胞化学染色方法.doc》
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