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细胞免疫荧光详细步骤

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细胞免疫荧光步骤：

1.细胞爬片；首先是玻片的处理，普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗衣粉洗干净，用水冲静烤干，然后泡酸过夜，捞酸后流水洗净，烤干，置于器皿中高压灭菌，然后再烤箱中大约8小时烤干备用。

爬片可以在培养皿六孔板或24孔板中都可，我选择在培养皿中爬。一为节约经费（培养皿可以重复利用）二来觉得培养皿口大，操作比较方便。培养皿消毒同上，消毒时记得消两把镊子
具体操作是：用胰酶消化好细胞，充分吹打，使之成单细胞悬液（注意：这一点很重要，关系到将来爬出来片子的质量）

取出消毒的培养皿，可以先加少量培养基（以使玻片与培养皿紧密接触），将玻片小心放入摆放其中，然后将单细胞悬液一滴一滴的滴到玻片上。最后盖上培养皿置于37度5％CO2的暖箱中培养，根据细胞生长状况，24小时或更长时间适时取出爬片。

爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒钟，然后在4％多聚甲醛中固定15分钟，然后再用37度去离子水将甲醛冲干净，注意手法轻柔，要不然掉片很厉害。同时操作过程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功尽弃。

将做好的爬片置于滤纸上晾干，然后用中性树胶粘在载玻片上。注意一定要等中性树胶彻底干了之后才能做后续实验，要不然玻片会掉下来的，就又是前功尽弃了做好的细胞爬片可以放在－20保存备用，具体能保存多长时间不太清楚，当然尽量早用。

2.4%多聚甲醛固定10min(固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮；

3.PBS漂洗5min；

4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化处理；

5.PBS漂洗2次，每次5min；

6.1%BSA封闭30min；

7.加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h；

8.PBS漂洗2次，每次5min；

9.加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h；

10.PBS漂洗2次，每次5min；

11.5ug/ml DAPI染色2min；

12.抗淬灭封片剂封片。

抗淬灭封片剂:
2.5% DABCO (w/v
50mM Tris(pH8.0
90%甘油

细胞免疫荧光

细胞爬片

4%多聚甲醛固定10min (固定细胞器用预冷的70%甲醇+30%丙酮

PBS漂洗5min
0.5% Triton 穿孔15min (丙酮固定法不用透化处理

PBS漂洗2次，每次5min
1%BSA封闭30min
加入1%BSA稀释的一抗，于37℃杂交2h
PBS漂洗2次，每次5min
加入1%BSA稀释的二抗，于37℃杂交1h
PBS漂洗2次，每次5min
5ug/ml DAPI染色2min
抗淬灭封片剂封片

2.5% DABCO (w/v 抗淬灭封片剂 50mM Tris(pH8.0 90%甘油

0.25g DABCO 9ml甘油
0.5ml 1M Tris(Ph8.0 70℃溶解，-20℃保存 0.5ml ddH2O

本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/e92d6ccf77c66137ee06eff9aef8941ea66e4bcf.html