正在进行安全检测...
发布时间:2023-10-31 00:14:27 来源:文档文库
小
中
大
字号:
方法一:
1. 首先需要把细胞养在玻璃片上(悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片)
2. 然后在4%PFA里面室温下固定30分钟,PBS洗两次,0.1% TX-100室温下作用1-2分钟使细胞膜通透。
3. 接下来进行荧光标记,需要在一个大的容器(面积大,扁平状的,比如大的培养皿)里面,放一张用水打湿的滤纸,以保持湿度。
4. 剪一片合适大小的parafilm,在上面滴上稀释在1%BSA/TBS中的一抗(稀释倍数依具体抗体而定),每个玻璃片30ul足够,把玻璃片盖在上面(细胞面朝下),室温下孵育30分钟,然后在PBS里洗三次。 5. 接下来二抗孵育步骤同上。
6. 最后,在载玻片加上mounting medium(大约每个玻璃片加10ul),把玻璃片放上去(细胞面朝下),37度30分钟,然后就可以在荧光显微镜下观察了。
7. 抗体很重要,不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗体,看看有没有杂带。 8. 双标的话,可以把两个一抗一起加或者分别标记两次(可以都试一下看看那种方法合适)。如果一个抗体需要二抗,一个是直接荧光标记的,可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。
方法二:
1. 选取一抗时要来源于两种不同的动物,我用的是来源于rabbit和rat的抗体,二抗则是不同荧光信号标记 的,我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。 2. 我的做法是两种一抗同时孵育,然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索,我感觉一抗4度孵育过 夜比较好,背景比较清晰。
3. 我的阳性对照用的是阳性组织切片,阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG,荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。
4. 封闭血清与二抗来源动物一致,我用的是10%的正常donkey血清。 5. 其余步骤同一般免疫荧光单标操作。
方法三:
1. 片子的制作:可以做细胞爬片,细胞甩片,还有直接在24well/12well/96well中直接染色 2.
细胞爬片的制作:直接购买公司的已经处理过的细胞爬片,要是自己制作的话,就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片 3. 细胞甩片:需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。
内容作参考
1
4. 其实小的well的话,可以直接拿来染色,没问题的。
5. 固定:用PBS洗去培养液,用固定液(如甲醇和丙酮;4%多聚甲醛;酒精。。。)固定细胞。 6. 内源性过氧化物酶处理,3%过氧化氢处理细胞(选作,二抗连HRP得必做,其他的如做免疫荧光染色不用做)。
7. 通透(胞浆蛋白和细胞核蛋白需要做;细胞膜蛋白不需要做),一般选用Triton-X100来做细胞通透,浓度和时间需要摸索,一般是0.1-5%,处理时间为1-30分钟,级个别需要到1-2小时。
8. 封闭:洗去通透液,用二抗同源的血清约10%的浓度in PBS中封闭半小时,也可以选用5-10%脱脂奶粉。封闭结束后千万不要洗,直接上一抗。
9. 一抗:具体你想做什么样的蛋白,咨询抗体公司如santa cruze,Abcam,sigma....。选取具体的抗体,但是一抗的稀释浓度也是要摸索,抗体稀释液可以购买抗体公司现成的,对于新手还是挺好的。时间一般是4度过夜或者37度1小时。一抗最好还是选用外国抗体公司的抗体。 10. 洗去一抗。
11.
上二抗,二抗一般抗体公司会给你推荐的,你在其中选上一个就行了,自己选国产的也行,就是选在哪个动物体内做的一抗,二抗就选抗那个动物的就行了。二抗的浓度也是需要摸索的,抗体稀释液和一抗相同就行了。二抗的时间一般是37度半小时。 12.
底物显色(选作,二抗连得是酶的必做,按试剂盒的说明书添加就行了,显色时间可能需要摸索,以免显色过度引起假阳性;二抗连得是荧光报告的不用做) 13. 洗去二抗,染核 14. DAPI或者Hoechst染核
15. 洗去染核液,加PBS,上镜观察。
方法四:
(1
细胞准备。对单层生长细胞,在传代培养时,将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中,待细胞接近长成单层后取出盖玻片,PBS洗两次;对悬浮生长细胞,取对数生长细胞,用PBS离心洗涤(1000rpm,5min2次,用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
(2 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5 min。
(3 通透。使用交联剂(如多聚甲醛固定后的细胞,一般需要在加入抗体孵育前,对细胞进行通透处理,以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min。通透后用PBS洗涤3×5 min。
内容作参考
2
(4 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭,时间一般为30min。
(5 一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次,每次冲洗5min