高中生物实验DNA的粗提取和鉴定实验中应注意的问题

高中生物实验DNA的粗提取和鉴定实验中应注意的问题

　　⑴充分搅拌鸡血细胞液。DNA存在于鸡血细胞的细胞核中。将鸡血细胞液与蒸馏水混合后，必须用玻璃棒沿一个方向快速搅拌，使鸡血细胞加速破裂，并释放出DNA。

　　⑵沉淀DNA时必须用冷酒精。实验前必须准备好大量的体积分数为95%的酒精，并在冰箱中至少存放24h。

　　⑶正确搅拌含有悬浮物的溶液。实验步骤3、5、7都需要用玻璃棒搅拌。在进行步骤3、5时，玻璃棒不要直接接触烧杯底部，而且搅拌要轻缓，以便获得较完整的DNA分子。进行步骤7时，要将玻璃棒插入烧杯中溶液的中间，用手缓慢转动5min～10min。

　　本实验中鉴定DNA的方法为二苯胺法。如果在没有二苯胺的情况下也可以用以下几种方法。

　　典例解析

　　下列关于“DNA的粗提取与鉴定”的实验原理中，说法错误的是

　　A.DNA在氯化钠溶液中的溶解度随溶液浓度的变化而改变

　　B.利用DNA不溶于酒精的性质，可除去细胞中溶于酒精的物质而得到较纯的DNA

　　C.DNA是大分子有机物，不溶于水而溶于某些有机溶剂

　　D.DNA溶液中加入二苯胺试剂经沸水浴后会出现蓝色反应

　　答案：C

　　下列关于实验操作的说法中，有误的是()

　　A.该实验中有两次加入蒸馏水，均是为了析出DNA

　　B.该实验学生操作中多次用到搅拌，除最后一步未强调方向外，其余均要求单向搅拌

　　C.该实验中有3次过滤，过滤时使用纱布层数与需用滤液或黏稠物有关

　　D.实验三次加入NaCl溶液，无论浓度是2mol/L，还是0.015mol/L，均是为了溶解DNA

　　解析：对照比较表可知，除A说法有误外，其余各项均正确。两次加蒸馏水，第一次是为了使细胞吸水破裂释放出核物质(DNA)，第二次是为了降低NaCl溶液的浓度从而析出DNA。

　　⑷DNA粘稠物的再溶解：;

　　⑸提取杂质较少的DNA白色乳状丝状物：;

　　⑹鉴定DNA是否存在可用试剂：。

　　解析：⑹鉴定DNA是否存在常用：二苯胺试剂沸水浴为蓝色反应;也可选用甲基绿试剂，其颜色反应为蓝绿色。(其它略)

　　答案：⑴蒸馏水⑵2mol/L NaCl溶液⑶蒸馏水⑷2mol/L NaCl溶液⑸冷却的体积分数为95%的酒精⑹二苯胺试剂或甲基绿试剂

　　(带*的为重点实验)

　　实验一：生物组织中还原糖、脂肪、蛋白质的鉴定**

　　实验材料的选择：

　　1.可溶性还原糖的鉴定：生物组织中的糖类有还原糖和非还原糖两类。常见的还原糖有葡萄糖、果糖和麦芽糖;蔗糖(甘蔗茎、甜菜的块根等)、淀粉(马铃薯、番薯的块茎等)是非还原糖。在双子叶植物中，光合作用的主要产物葡萄糖形成后，合成为淀粉暂时储存在叶子内，因此最好不用双子叶的叶子作为实验的材料。有些单子叶植物，如韭菜，叶子内虽然含有大量的可溶性还原糖，但由于叶片中叶绿素颜色较深，对于鉴定时的颜色反应起着遮盖作用，导致实验现象不明显，一般也不选用。本实验最理想的实验材料是还原糖含量较高的植物组织，而且要求组织的颜色较浅或近于白色，如苹果和犁的果实，也可以用白色的甘蓝叶、白萝卜替代。

　　经实验比较，颜色反应的明显程度依次为：苹果、梨、白色甘蓝叶和白萝卜。

　　脂肪的鉴定：所用材料要求一脂肪含量高，二有一定大小做徒手切片，花生种子符合本实验的要求。实验前要将花生种子浸泡3~4h，有利于切成薄片，但浸泡时间也不宜过长，否则组织太软，切下的薄片不易成形。

　　试剂的选用及注意事项：

　　可溶性还原糖鉴定过程中，因斐林试剂很不稳定，故应将组成试剂的两种溶液分别配制，使用是再加以混合，即现配现用。切不要将甲液和乙液分别加入组织样液中。实际上这个反应利用的是斐林试剂中的氢氧化铜作为弱氧化剂参与还原糖的反应，而氢氧化铜放置过久沉淀过多则不利于反应。

　　在水浴加热时，试管底部不要触及烧杯底，以防止试管受热不均匀而爆裂;并注意试管口也不要朝向自己或他人，防止沸腾的溶液冲出试管造成烫伤。另外，加入的斐林试剂不要太多，反而会使实验效果不理想。

　　脂肪鉴定实验键是能否切出符合要求的薄切片，太厚光线不能通过。

　　蛋白质的鉴定实验中，使用双缩脲试剂时，应先加试剂A(NaOH)，造成碱性环境后再加入试剂B(CuSO4)(注意和使用斐林试剂的区别)。另外试剂B不能太多，否则硫酸铜的蓝色将遮盖颜色反应的真实效果。

　　使用原理不同

　　斐林试剂是新配制的Cu(OH)2溶液，它在加热的条件下与醛基反应，被还原成砖红色的Cu2O沉淀，可用于鉴定还原糖的存在，实验中溶液颜色的变化过程为：浅蓝色----棕色-----砖红色

　　鉴定生物组织中是否含有蛋白质时，常用双缩脲法，使用的是双缩脲试剂，发生的是双缩脲反应。双缩脲反应的实质是在碱性条件下，Cu2+与双缩脲发生的紫色反应。而蛋白质分子中有很多与双缩脲(H2NOC-NH-CONH2)结构相似的肽键，所以蛋白质都能与双缩脲发生颜色反应，可以使用双缩脲试剂鉴定蛋白质的存在。

　　使用时的注意事项：

　　1.显微镜的镜头有两种：目镜和物镜。目镜可从镜筒上端开口处插入，目镜长度与放大倍数成“反比“，即目镜越长，放大倍数越小;目镜越短，放大倍数越大。而物镜的上端有螺丝，可旋转固定在镜筒下端连接的转换器的3个开口上，且物镜长度与放大倍数成“正比”，即越长，放大倍数越大。焦距调好后镜头与盖玻片的距离越远，物镜越短，放大倍数越小;反之，放大倍数越大。显微镜的放大倍数为目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积。

　　在显微镜下所成物象为倒立放大的虚象。

　　此外，由于低倍物镜的通光量比高倍物镜的通光量大，所以低倍镜的视野较明亮;而高倍物镜，虽然放大倍数大，实际观察到的标本区域小，视野教暗

　　视野中出现异物有三种情况：在物镜上、目镜上和装片上。如移动装片异物不动，说明不在装片上;转动转换器，换上高倍镜，仍可观察到，说明不在物镜上，可判断异物在目镜上。

　　低倍镜观察：将装片放到载物台上，使标本正对通光中心，用压片夹压住装片;双眼注视物镜，转动粗准焦螺旋，下降镜筒至距玻片2mm~3mm处(不要让物镜触及玻片)，左眼注视目镜转动粗准焦螺旋，上升镜筒，当看到物像时，调节洗准焦螺旋，直到看清物象为止。转动转换器，当由低倍镜转换成高倍镜时，物象变大，视野范围变小、变暗，因此，换高倍镜之前，一定要把观察的物象移到视野的中央，并且将反光镜的平面镜换成凹面镜，同时扩大光圈。

　　使用显微镜的程序：取镜-----安放----对光---压片---观察

　　下降镜筒时，一定要侧目注视物镜，防止镜头触及玻片而压碎玻片或损坏透镜

　　观察植物细胞的有丝分裂**

　　选材：应选取有丝分裂旺盛的细胞，如植物根尖分生区的细胞

　　解离就是用要药液使组织的细胞相互分离开来，便于最后制片时能被压成一薄层进行显微观察。解离液中酒精的作用是迅速杀死细胞，固定细胞的分裂相;而盐酸的作用是使洋葱细胞的细胞壁软化，并使细胞间的中胶层物质溶解，从而达到分离细胞的目的。另外解离时间不宜过短，否则根尖未充分解离，压片时细胞分不开;但又不能太长，否则使根尖过分酥软，无法进行漂洗和染色，且染色体成分被破坏。这一步是实验成功与否的关键

　　漂洗的目的是去除根中多余的解离液，特别是盐酸，因为染色时用的是碱性染料龙胆紫，酸与碱发生反应会影响染色效果

　　染色时间亦不能过长，否则会使染色体与周围的其他结构均被着色，这样就无法形成颜色上的反差，不便于观察。

　　在制片时要用拇指按压盖玻片，目的是使细胞分散，不至于重叠。

　　显微镜下观察到的细胞被固定在有丝分裂的某个阶段，若在视野中找不到处于某个时期的细胞时，可以适当移动玻片

　　遵循等量性原则

　　酶催化结果的检验：因为淀粉的水解产物中有还原性糖，故可以用斐林试剂检验还原糖的存在，从而说明淀粉酶催化水解了淀粉;而蔗糖则不能水解，其本身不能与斐林试剂反应。所以此实验的关键在于蔗糖的纯度和新鲜度，如果其中混有少量的葡萄糖或果糖，或蔗糖放置久了受细菌作用，部分分解成了单糖，则与斐林试剂共热时能生成砖红色的沉淀，使人产生错觉。

　　叶绿体中色素的提取和分离**

　　取材时要选用新鲜的颜色较深的叶片，以便使滤液中含较多的色素

　　研磨时加入二氧化硅的目的是为了研磨的充分，更有效的破坏细胞结构;加入少许碳酸钙的目的是为了防止在研磨过程中，叶绿素受到破坏。因为叶绿素分子结构中含有一个镁原子，当细胞破裂时，细胞液内有机酸的氢可以取代镁原子而成为褐色的去没叶绿素，碳酸钙可中和有机酸以防止去镁反应的发生

　　研磨时要迅速、充分。一是因为丙酮容易挥发;二是为了使叶绿体完全破裂，从而能提取出较多的色素;二是叶绿素极不稳定，能被活细胞中的叶绿素酶水解而破坏。

　　制备滤纸条时，要将滤纸条的一端剪去两角。这样可以使色素在滤纸条上扩散均匀，便于观察实验结果。

　　画滤液细线时，一定要细且直。这样可以防止色素带重叠，使色素分子均匀分布在一条直线上，做到扩散起点一致。重复划2~3次，是为了增加滤液细线上的色素分子数量，使实验效果更加明显。

　　实验材料的选择

　　最常用的实验材料是紫色洋葱鳞片。它的外表皮细胞的液泡较大，细胞液中有紫色的花青素，在显微镜下，紫色大液泡十分明显，能方便地观察到质壁分裂及其复原的过程。如无紫色洋葱，可用葫芦藓或其他藓类植物的叶片代替。选择材料必须都是活细胞，因为只有活细胞的原生质才具有选择透过性，否则将不会出现质壁分离及其复原现象/

　　由于细胞壁是全透性的，而细胞膜具有选择透过性，因此，在质壁分离后。细胞壁以内细胞膜以外的物质是外界溶液，即蔗糖

　　质壁分离能够发生的外界条件是因为外界溶液的浓度大于细胞液的浓度。因此通过具有一系列浓度梯度的溶液依次做质壁分离实验，观察植物细胞发生质壁分离的临界浓度，即可测的细胞液的浓度。

　　实验中应注意以下几点：

　　制备鸡血细胞液时，要在去新鲜鸡血的同时加入抗凝剂，使血液分层，取下层血细胞沉淀。另外，此实验的材料不能用哺乳动物(如人、狗)的血替代。

　　获取较多DNA的关键是向鸡血细胞液加入足量的蒸馏水，以便使细胞膜和核膜破裂，核内物质释放出来。

　　特别要注意实验中的3次过滤：第一次过滤的目的是为了除去血细胞破裂后残余的膜碎片以及细胞器碎片，第二次过滤(加水稀释NaCL)是为了初步将DNA与溶解在NaCL溶液中的蛋白质等有机物以及其他杂质分离，第三次过滤(用酒精)是为了进一不除去蛋白质等有机物，从而得到较纯净的DNA.第一、三次过滤要用滤液，使用的纱布为1~2层;第二次过滤要用滤出的粘稠物，使用的纱布是多层。

　　实验中有6次搅拌，除最后一次搅拌外，前5次搅拌均要朝向一个方向，并且在析出DNA，DNA再溶解和提取中，各步搅拌都要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，防止DNA分子断裂。

　　特别注意实验中有两次使用蒸馏水：一次在第1步，加水是为了使血细胞洗水膨胀破裂，加水后必须充分的搅拌，不应少于5min，使血细胞充分破裂;第二次加蒸馏水是在第3步，加水是为了喜事氯化钠溶液。

　　性状分离比的模拟实验

　　实验中的两个小筒，分别相当于动物体内储存精子和卵细胞的器官(精巢和卵巢)。为了保证D和d配子与自然状态下相似，即1：1，小筒内的D和d小球的数量应该相等。而且抽取小球时，为了保证每次抽取到D或d的概率相等，应该进行有放回的抽取。抽取的过程即为受精。

　　看看网友们都有什么想法

　　网友1

　　1.试材选取：由于禽流感的原因，现在我们一般都使用植物性的试材，比如菜花，取用菜花的表头花最好。

　　2.研磨：使用研磨过滤器研磨试材，加入2-3ml的研磨液，充分研磨3-5min。

　　3.提取DNA：用微量可调移液器吸取1ml的研磨过滤液转移到试管中，缓慢贴试管壁加入两倍体积冷的无水乙醇，待到有白色絮状物析出时，慢慢旋转试管使其析出物充分缠绕在一起。

　　3.鉴定：用玻璃棒将白色析出物转移到另一个试管中，加入1ml的蒸馏水，充分振荡使白色DNA溶解，加入1ml配置好的二苯胺试剂，放入到沸水浴中加热10min即可观察实验效果。按照同样的方法制作对照组，最后进行比对。

　　网友2

　　2、制备鸡血细胞液时，要加入柠檬酸钠(抗凝剂)，使血液分层，取下层血细胞。

　　3、获取DNA时要向鸡血细胞液加入足量的蒸馏水，以便使细胞膜和核膜破裂，核内物质释放出来。

　　4、实验中共三次过滤，过滤时使用的纱布层数与取其滤液或粘稠物有关。第1、3次要用其滤液，使用的纱布为12层，第2次是要用其滤出的粘稠物，使用的纱布为多层。

　　5、实验中有6次搅拌，除最后一次搅拌外，前5次搅拌均要朝一个方向。并且，在析出DNA、DNA再溶解和提取中，各步搅拌都要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，防止DNA分子断裂。

　　6、实验中有2次加蒸馏水。一次是在第一步，加水是为了使血细胞吸水膨胀破裂，加水后必须充分搅拌，使血细胞充分破裂；第二次加蒸馏水是在第三步，是为了稀释氯化钠溶液。

本文来源：https://www.2haoxitong.net/k/doc/dfbb19c5cd7931b765ce0508763231126fdb77c7.html