感受态细胞制备及各种感受态的特点
发布时间：2023-02-20 11:55:59 来源：文档文库
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.感受态细胞制备制备感受态常用的方法是电击法和CaCl制备法，以下介绍CaCl制备法：221、可以从-80℃冰柜中，取出一支冻存菌株，于事先照过紫外的超净台中，用无菌的接种环轻轻蘸取菌种后，在无抗平板（由于Rocetta含有氯霉素抗性，需要涂布在氯霉素抗性的平板，后面的都是如此）上划线，并将菌种迅速放回-80℃保存，在划线板上做好相应标记，于37℃培养过夜。2、从37℃培养过夜的新鲜平板上挑取一个单克隆，接种于2mlEP管中，37℃，220rpm震荡培养约6个小时至对数生长中后期；将该菌悬液以1:100的比例接种于50mlLB液体培养基（2瓶）中,37℃振荡培养2.5小时至OD600=0.5。注意：接种比例不得大于1:10。3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷的离心管（50ml）中，在冰上放置5~10min；注意：划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板和多接一根试管，划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。4、4℃5000g离心5分钟。用预冷的去离子水洗涤沉淀，4℃5000g离心5分钟；Note：此步主要是为了洗去培养基中的盐等
5、沉淀加入2ml预冷的0.05mol/LCaCl-15%甘油混合溶液，轻吹散，冰浴5分钟，4℃5000g2离心5分钟；6、沉淀加入2ml预冷的0.05mol/LCaCl-15%甘油混合溶液，轻吹散，即成为感受态细胞2悬液。分装成50~100μl的小份，贮存于-70℃可保存半年。含15%甘油的0.05mol/LCaCl制备方法:2称取0.28gCaCl(无水,分析纯,溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭2菌。感受态细胞的特征感受态：通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源DNA的状态。感受态细胞的特征：（1）细胞表面暴露出一些可接受外来DNA的位点（以溶菌酶处理，可促使受体细胞的接受位点充分暴露）。（2）细胞膜通透性增加（用钙离子处理，可使膜通透性增加，使DNA直接穿过质膜进入细胞）。（3）受体细胞的修饰酶活性最高，而限制酶活性最低，使转入的DNA分子不易被切除或破坏。实验室常用的感受态细胞1/4.
